Skip to main content

ISOLASI PROTEIN,WESTERN BLOTTING DAN SDS-PAGE


LAPORAN PRAKTIKUM 
TEKNIK ANALISIS BIOLOGI MOLEKULER
ISOLASI PROTEIN,WESTERN BLOTTING DAN SDS-PAGE









OLEH :
HABYB PALYOGA
105130101111089





PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN 
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012

BAB I 
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Protein merupakan suatu zat yang terdapat di dalam makanan yang sangat penting bagi tubuh,karena berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Juga sebagai sumber asam amino yang mengandung unsur C,H,O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak maupun karbohidrat. 
Selain itu protein juga memiliki fungsi sebagai bahan structural seperti halnya polimer lainnya. Protein memiliki rantai panjang dan dapat mengalami cross linking. Sehingga protein juga berperan dalam biokatalis suatu reaksi-reaksi kimia dalam makluk hidup. Makromolekul itulah yang mengendalikan metabolism yang kompleks dan menjaga kelangsungan hidup suatu orgenisme. (Santoso,2008)
Berhubungan dengan hal yang diatas,jika terjadi suatu kelainan dalam biokatalis suatu makhluk hidup maka akan terlihat dengan jelas dengan kelainan proteinnya. Sehingga diperlukan beberapa uji yang dibutuhkan untuk mengetahuinya. Salah satunya adalah dengan uji Western Blotting dan SDS PAGE untuk mengetahui jenis dan berat molekul suatu protein. Namun sebelum  dilakukan uji diatas harus diterapkan isolasi protein terhadap sampel yang diambil. Agar protein murni dari sampel bisa didapat sehingga uji tersebut bisa dilakukan dengan baik dan benar. 
Salah satu bidang yang sangat butuh pengetahuan dan praktik dari uji ini adalah bidang kesehatan khususnya dunia Kedokteran Hewan. Karena beberapa jenis abnormalitas pada animalia harus melakukan serangkaian uji untuk menentukan diagnose agar efek terapi dari obat bisa didapatkan dengan hasil maksimal dan  meminimalkan efek toksik karena kesalahan dalam pemberian dosis obat.
Berdasarkan  latarbelakang diatas,sekiranya mahasiswa harus tau dan paham bagaimana konsep dan praktik dari Isolasi Protein,Uji Western Blotting dan SDS PAGE agar bisa menjadi dokter hewan yang bisa dipertanggung  jawabkan pekerjaannya. Selain itu,praktikum  ini juga sebagai salah satu kewajiban dalam memenuhi tuntutan akademik Fakultas Kedokteran Hewan sebagai perwujudan visi misi fakultas untuk mencetak provesi dokter hewan yang bisa diandalkan didalam dan luar negeri.
1.2 Tujuan
  • Untuk mengetahui teknik-teknik yang digunaakan saat Isolasi Protein,Western Blotting dan SDS PAGE
  • Untuk mengetahui jenis protein pada suatu sampel
  • Untuk mengetahui reaksi-reaski yang terjadi saat isolasi protein,western blotting dan SDS page.


1.3 Manfaat
  • Dapat mengetahui dan mempraktekan teknik-teknik yang digunakan saat isolasi protein,western blotting dan SDS PAGE khususnya untuk bidang Kedokteran Hewan
  • Dapat mengetahui jenis-jenis protein pada suatu sampel sesuai dengan visualisasi hasil percobaan
  • Mengetahui dengan baik reaksi-reaksi yang terjadi saat isolasi protein,western blotting dan SDS PAGE


BAB II 
METODOLOGI
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Isolasi Protein,Western Blotting dan SDS PAGE dilakukan pada tanggal 12 November 2012 jam 13.00 sampai selesai di Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Brawijaya Malang,Jawa Timur.

2.2 Alat dan Bahan
2.2.1 Isolasi Protein
Adapun alat-alat yang digunakan saat isolasi protein antara lain : 4 tabung mikrotube steril,mikropiprt dengan ukuran 0,5 – 10 mikrolit,cawan,penggilas,mortar,sentrifuge,vortex dan incubator. Serta bahan-bahan yang dibutuhkan adalah organ hepar mencit,buffer lysis 500 mikrolit,phenol klorofoam isoamil alcohol (PCL) 500 mikrolit,choloroform isoamil alcohol (CL) 500 mikrolit,ethanol absolute 500 mikrolit,ammonium asetat ( 7,5 M) 50 ml.
2.2.2 Western Blotting
Adapun alat-alat yang digunakan saat praktikum western blotting anatara lain  Semi dry transver cell,Pinset,Power Supply,Scanner,Glove dan Masker sedangkan bahannya yaitu Blot buffer,Membran PVDF,Blotto 5 gr,kertas whatman,TBS dan pewarna panceau.
2.2.3 SDS PAGE
Alat yang dibutuhkan pada saat praktikum Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Elektrophoresis (SDS-PAGE) antara lain : Mikrotube,mikropipet,yellow tip,spin down Scanner, dan botol flacon. Sedangkan bahan yang dibutuhkan separating gel 12,5%,ddH20 1363,5 mirkolit,akrilamid 1861,5 mikrolit,Fris cl ph 8,8 1125 mikrolit,SDS 10% 75 mikrolit,APS 10% 75 mikrolit dan Temed 5 mikrolit. Kemudian pada pembuatan Stacking Gel 4% dibutuhkan ddH2O 2,11 ml,Tris Cl ph 6,8 0,38 ml,Stok bisoakrilamid 30% 0,45 ml,SDS 10% 30 mikrolit,APS 10% 30 mikrolit,Temed 5 mikrolit. Serta dibutuhkan bahan tambahan seperti sampel protein,marker astein,RSB 10 mikrolit (mengandung Tracking dye,Gliserol,beta marcopto etanol 2 %,serum ditambah RSB (1 : 1) dan buffer.
2.3 Cara Kerja 
2.3.1 Isolasi Protein
Pertama,siapkan organ hepar pada mencit,dan dimasukkan ke dalam mikrotube,lalu darah yang terdapat disana ditambahkan dengan buffer lysis 500 mikrolit. Setelah itu divortex selama 10 samapi 20 detik. Darah yang dihasilkan kemudian di inkubasi dalam suhu 55 C selama 10 menit. Setelah diinkubasi kemudian ditambahkan dengan PCL 500 mikrolit dan divortex selama 10 sampai 20 detik. Kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi kecepatan 1200 rpm selama 10 menit dengan suhu 25 C. Kemudian di ambil supernatannya dan ditambahkan dengan CL 500 mikrolit. Sesudah itu di vortex lagi selama 10-20 detik,disentrifus lagi dengan kecepatan 1200 rpm dengan suhu 15 C selama 10 menit. Selanjutnya,ambil upperface supernatannya kemudian ditambahkan dengan ethanol absolute 500 mikrotube,ditambahkan ammonium asestat 7,5 M 50 ml. Dan dibolak-balik serta dikocok. Kemudian di inkubasi dengan suhu -2- C lebih kurang selama 30 menit.
2.3.2 Western Blotting
Western Blotting terbagi menjadi 2 yaitu Direct dan Indirect. Adapun proses direct antara lain : Pertama,bersihkan alat semi sry transfer cell dengan menggunakan larutan etanol 70 %,kemudian pasangkan kertas whatman  sebanyak 9 lapis. Akan tetapi kertas tersebut direndam dulu di dalam larutan buffer . Perlu diingat,disetiap lapisan itu harus dilakukan dengan hati-hati dan tidak ada terjadi gelembung di setiap lapis. Kemudian lapisan itu diletakkan di membrane PVDF yang sudah direndam terlebih dahulu dengan buffer. Diatasnya dilapisi lagi dengan 6 lapis kertas whatman. Setelah selesai alat penutup semi dry transver dipasang dan dialiri arus melalui power suplai sebesar 0,16 volt selama 1 jam. Kemudian arus dilepas dan gel diambil untuk dilakukan pewarnaan ponceau.
Secara indirect hal yang dilakukan antara lain ; Pertama membuat western blot direct,akan tetapi setelah pewarnaan ponceau direndam denagn larutan blotto 5 % selama 30 menit. Setelah itu di cuci denagn PBST 3 x selama 5 menit. Setelah dicuci sebanyak 3 kali kemudian diberi antibody primer,dan dicuci lagi dengan PBST sebanyak 3 kali selama 5 menit. Kemudian diberikan antibody sekunder lalu dicuci lagi dengan PBST sebanyak 4 kali. Kemudian diwarnai dengan NBT-BCIP. Setelah diwarnai lalu dibersihkan dengan aquades dan masukkan dalam plastic untuk dilakukan scan dengan alat scanner.
2.3.4 SDS PAGE
Langkah pertama yang dilakukan antara lain mengambil sampel protein menggunakan mikropipet sebanyak 10 mikrolit,kemudian tambahkan RSB 10 mikrolit. RSB adalah pereduksi protein atau lebih dikenal reducing sample protein. Kemudian di ambil serum dari tikus sebanyak 10 mikrolit,setelah diambil dilakukan spin down hingga 7000 rpm lalu dipanaskan dengan suhu 100 C selama 10 menit. Setelah dipanaskan bahan tersebut dimasukkan pada sumuran gel sebanyak 5 sampai 10 mikrolit. DImana dalam gel terdapat 10 sumuran. Setelah bahan tersebut dimasukkan ke sumurnya masing-masing maka dilakukan running  dengan arus listrik sebesar 150 volt selama kira-kira 1 jam . Setelah satu jam,plate dibuka dengan aquades ataupun gel diangkat dari plate. Setelah itu direndam dengan larutan CBB sampai pita yang diinginkan keluar/terlihat. Kemudian bersihkan lagi dengan akuades lalu lakukan stunning dan gel dimasukkan dalam plastic untuk dilakukan scanning.

BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
3.1.1 Isolasi Protein 
Hasil pada isolasi protein berhasil,yaitu ditemukan pita-pita protein pada uji lanjutannya,antara lain uji western blotting dan SDS PAGE.
3.2.2 Western Blotting
Pada western blotting dengan actin antibody terlihat visualisasi samar-samar.
Pada western blotting dengan pewarnaan ponceau gambar sangat buram dan terkesan tidak ada protein disana. Tidak ada protein yang tertransver.
3.2.3 SDS PAGE
Terlihat visualisasi protein. Namun pada baris pertama tidak terlihat visualisasi (marker paling kiri) karena marker kekeringan saat proses pemanasan. Kemudian terdapat perbedaan pita dan panjang berbeda. Dimana perbedaan ukuran berarti protein tersebut berbeda.

3.2 Pembahasan
3.2.1 Isolasi Protein
Pada praktkum Isolasi Protein yang kami lakukan pada tanggal 12 November 2012 didapatkan hasil yang lumayan memuaskan. Dimana ditemukan protein pada visualisasi Western Blotting maupun SDS PAGE. 
Adapun fungsi isolasi protein yaitu untuk mendapatkan protein murni (100 % protein) agar memudahkan pada uji lanjutan yang dilakukan antara lain contohnya uji immunoblotting atau dikenal western blotting begitu juga uji SDS PAGE. 
Secara sederhana,proses dari isolasi protein ini konsepnya sama dengan isolasi DNA. Dimana buffer lysis berfungsi untuk melisiskan sel sehingga semua hal yang terdapat didalamnya akan bisa tercampur sampai homogen. Kemudian akan dilakukan proses sentrifuge,hal ini dimaksudkan untuk memisahkan perbedaan berat molekul dan protein berada di supernatant dan tindakan ini dilakukan berlaku berkali-kali demi mendapatkan isolate protein yang paling murni. Semakin murni suatu isolate protein,maka uji selanjutnya akan semakin baik akan tetapi membutuhkan waktu yang makin lama.

3.2.2 Western Blotting
Western blotting atau immunoblotting merupakan uji yang digunakan untuk mendeteksi protein yang spesifik. Pada saat praktikum,kami menggunakan antibody antiactin sehingga pada gambar bisa terlihat dengan jelas pita actinnya.
Pada gambar di kiri,bisa terlihat pita actin yang samar-sama namun terlihat dengan sempurna. Hal itu bisa terjadi karena antibody anti actin bisa berikatan dengan protein yang spesifik yaitu protein actinnya. Karena actin disana berperan sebagai antigen sehingga akan diikat oleh antibody anti actin. 
Sehingga bisa dipastikan hasilnya berhasil walaupun beberapa kesalahan kekurangan masih bisa ditemukan,yaitu hasil masih belum jelas,dan ada beberapa noda yang seharusnya tidak ada.
Hal itu bisa terjadi karena kesalahan pada saat memasukan bahan ke dalam well,atau sumurannya. Serta bisa diseababkan voltase yang tidak stabil sehingga kesalahan pada saat separasi dan lain sebagainya. 

3.2.3 SDS PAGE
Berdasarkan gambar diatas,ditemukan protein yang sangat baik dan jelas. Akan tetapi pada gambar paling kiri (kosong),itu merupakan tempat marker. Akan tetapi,marker tidak terlihat akibat kesalahan yang kami lakukan saat pemanasan. Dimana dalam proses pemanasan kami melakukan terlalu lama sehingga bahan tersebut menjadi kering dan tidak bisa-
penetrasi ke dalam gel dengan sempurna dan tidak terlihat gambaran pitanya. Kemudian pada gambar juga terlihat perbedaan pada panjang dan lebar dari pita protein. Hal ini dikarenakan protein yang penetrasi waktu start –nya tidak sama. 
Dimana saat memasukkan bahan ke dalam tempatnya,kami melakukan dengan durasi yang lama karena memasukkan dengan mikropipet membutuhkan ketelitian,apalagi kami sebagai pemula sehingga durasi yang dibutuhkan agak panjang. Kemudian pada saat pembuatan gel agak miring sehingga berpengaruh pada hasil. 
Pada gambar ditemukan perbedaan panjang dari pita-pita protein tersebut. Hal tersebut dikarenakan perbedaan dari berat molekul yang terkandung di dalam bahan yang diisikan pada setiap lubang pada alat tersebut. Pada gambar tiga terakhir memiliki pita lebih pendek dibandingkan yang lainnya,karena jumlah proteinnya disana lebih sedikit atau tidak ada sama sekali,sehingga pitanya tidak tervisualisasi sampai ke bawah. 
Terakhir,ada ditemukan beberapa gelembung pada sampel,hal ini seharusnya tidak terjadi,karena akan mempengaruhi penetrasi bahan di dalam gel,tapi untungnya pada praktikum kali ini,gelembung berada paling bawah,sehingga hasil tidak berpengaruh.
SDS PAGE pada umumnya hanya digunakan untuk menseparasi semua protein sesuai dengan berat molekulnya,sehingga pada pita tersebut,semakin besar berat molekulnya maka akan mendapatkan hasil pita yang lebih panjang dan baik. 
Perbedaan mendasar SDS PAGE dengan Western Blotting yaitu pada spesifikasi ujinya,dimana SDS PAGE hanya untuk mengetahui berat molekulnya,sedangkan pada western blotting lebih ke arah yang lebih spesifik,yaitu digunakan antibodi spesifik (antibody antiactin pada saat percobaan) dimana akan mengikat antigen spesifikanya dari proetein tersebut yaitu antigen actin pada saat kami percobaan. 
Adapun fungsi menggunakan elektroforesis karena terjadi berbedaan muatan antara positif dan negative sehingga bahan akan penetrasi kedalam gel sehingga akan tercipta visualisasi protein sesuai dengan yang diharapkan.

BAB IV 
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Pada praktikum Isolasi Protein,Western Blotting dan SDS PAGE yang dilakukan pada tanggal 12 November 2012 di Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas MIPA didapatkan hasil yang cukup memuaskan. Dimana protein tervisualisasi dengan baik walaupun dibeberapa percobaan mengalami kegagalan seperti hasil visualisasi tidak sama start maupun gel yang miring. Hal ini masih bisa dimaklumi karena praktikum pertama kali. Dan dengan praktikum ini sangat dibutuhkan oleh dokter hewan yaitu sebagai salah satu cara mendeteksi protein-protein yang menyebabkan abnormalitas pada animalia khususnya. Sehingga bisa mengobati maupun mencegah dengan terapi yang lebih spesifik sesuai dengan abnormalitas yang terjadi berdasarkan kaedah yang berlaku.
4.2 Saran
Adapun saran untuk praktikum ini antara lain ;
  • Alat harus digunakan dengan semestinya sesuai dengan panduan penggunaan ala yang baik dan benar supaya mendapatkan hasil praktikum yang maksimal dan sesuai dengan yang diharapkan.
  • Bahan-bahan dalam praktikum harus diukur dengan teliti dan sesuai dengan teknik dan pencampuran yang pas agar mendapatkan hasil yang bisa dipertanggung jawabkan nantinya.
  • Praktikum harus dilaksanakan dengan kondisi steril untuk mengurangi dampak kontaminasi dengan menggunakan masker maupun gloves sekaligus sebagai alat untuk melindungi praktikan. 
  • Mulailah praktikum dengan doa demi kelancaran praktikum.


DAFTAR PUSTAKA

Anonim.1990. Protein ; http://id.wikipedia.org/wiki/protein (diakses pada tanggal 13 November 2012 jam 18.00 WIB)

Anonim.1999. Western Blotting. http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot (diakses pada tanggal 13 November 2012 jam 18.00 WIB)

Anonim.1999. SDS PAGE. http://en.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE (diakses pada tanggal 13 November 2012 jam 18.00 WIB)

Gunawan,Andang.1999. Food Combining : Kombinasi Makanan Serasi Pola Makan untuk Langsing dan Sehat.Jakarta ; Gramedia Pustaka Utama

Santoso.2008. Protein dan Enzim.Yayasan Farmasi Indonesia.Yogyakarta
Thomasson,Bill. 2011. Unraveling the Mystery of Protein. FASEB Office Public Affair.New York.



Comments

Popular posts from this blog

Lowongan Pekerjaan : Dinas Ketahanan Pangan dan Pertanian Kota Surabaya

Dokter-hewan.net - Dalam rangka meningkatkan pelayanan pada Klinik Hewan dan pengendalian pemotongan Betina Produktif, maka dibutuhkan tenaga Medik Veteriner dengan kriteria sebagai berikut : Menguasai rektal, penyakit hewan dan pengobatan hewanBerkelakuan baik, sehat jasmani rohani dan bebas narkobaLulusan PT Negeri atau PT Swasta bereputasi baik dengan IPK min. 2,75 (skala 4)Usia maksimal 35 TahunDiutamakan Laki-laki Warga SUrabaya (KTP) Surabaya Lamaran diajukan kepada Sekretariat Dinas Ketahanan Pangan dan Pertanian Kota Surabaya Jl. Pagesangan II No. 56 (60233) Surabaya dengan disertai kelengkapan sebagai berikut :  Surat lamaranCVPas Foto berwarna 4x6 sebanyak 2 buahFotokopi KTPFotokopi Ijazah dan transkrip nilaiFotokopi sertifikat khusus (STRV dan Kompetensi) yang di klinik, paling lambat tanggal 20 November 2017 Melalui surat ini mohon bantuan untuk mengumumkan dilingkungan kampus, atas kerjasamanya disampaikan terima kasih. 
Kepala dinas,  Ir. JOESTAMADHI, M.Si

Bahayakah Alkohol untuk Hewan?

Dokter-hewan.net - Beberapa hari belakangan ini dunia maya digegerkan dengan video online yang di upload oleh oknum di salah satu media sosial populer di Indonesia. Dalam adegan tersebut, terlihat oknum tersebut memberikan minuman ber-alkohol kepada hewan yang ada di disana. Netizen tambah geram karena oknum tersebut melakukannya untuk bersenang-senang bersama teman-temannya.  Anjing, kucing dan hewan lainnya tidak baik terpapar dengan alkohol karena alkohol adalah racun bagi mereka. Jangankan untuk meminum alkohol, makanan fermentasi yang mengandung sedikit alkohol saja dapat berdampak buruk bagi kesehatan mereka. 
Beberapa minuman beralkohol lebih berbahaya bagi hewan kesayangan, misalnya beer yang mengandung 4% alkohol, wine 10% alkohol bahkan liquor bisa mencapai 90% alkohol. Persentase alkohol di dalam minuman akan berdampak semakin buruk bagi kesehatan hewan. Bahkan, sedikit saja jumlah alkohol yang tertelan berpotensi menyebabkan kematian. 
Seperti halnya pada manusia, ketika …

Lowongan Kerja : Klinik Hewan Akeso di Brunei Darussalam

Dokter-hewan.net - Klinik hewan Akeso yang terletak di negara Brunei Darussalam membutuhkan dokter hewan praktisi dengan kualifikasi sebagai berikut : Pria/WanitaBerpengalaman/Fresh GraduateDisiplin, Bertanggung Jawab dan dapat bekerja dalam tim. Telah selesai menempuh pendidikan dokter hewan (drh). Jika anda tertarik, silahkan kirimkan lamaran anda ke email akeso.vet@gmail.com dengan ketentuan, attach file sebagai berikut :  Pas Photo Scan Identitas diri (KTP/Passport)CVResumeScan Ijazah dan TranskripScan Sertifikat yang berkaitan.  Selamat mencoba : )